La réaction en chaîne de la polymérase est plus sensible que la culture virale et les tests antigéniques pour la détection des virus respiratoires chez les adultes atteints de cancer hématologique et de pneumonie

Nous avons analysé rétrospectivement la valeur de la réaction en chaîne par polymérase PCR pour la détection des infections virales respiratoires chez les patients atteints de cancer hématologique dont les échantillons de lavage broncho-alvéolaire étaient conservés. Des prélèvements naso-narinaires et des prélèvements sanguins avaient également été réalisés. virus viraux, virus respiratoire syncytial, rhinovirus, virus grippaux A et B, entérovirus et coronavirus Les cultures virales ou les tests antigéniques des échantillons de BAL ont révélé la présence de virus respiratoires chez les patients. identification de% à% P & lt; Nous avons conclu que la PCR est plus sensible que la culture virale ou les tests antigéniques ou sérologiques pour la détection des virus respiratoires chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques, et qu’elle offre la possibilité d’une détection précoce et rapide. diagnostic

La pneumonie est l’une des complications infectieuses les plus courantes de la transplantation de cellules souches. SCT et traitement cytotoxique des malignités hématologiques Traditionnellement, les infections pulmonaires chez les patients qui subissent SCT ou qui reçoivent des agents cytotoxiques ont été principalement attribuées aux bactéries, champignons et herpèsvirus. Les virus respiratoires sont de plus en plus reconnus comme causes importantes de maladies graves des voies respiratoires inférieures chez ces patients Le virus respiratoire syncytial RSV, les virus grippaux, les virus parainfluenza, les adénovirus et les picornavirus ont tous été identifiés comme pathogènes importants des infections nosocomiales. La culture virale est le «gold standard» pour le diagnostic en laboratoire des infections virales respiratoires. Cependant, elle ne convient pas comme test de diagnostic rapide, car la culture prend habituellement des jours pour produire des résultats, et sa valeur clinique est donc limitée. limitations, plus de technologie de diagnostic rapide Ces techniques fournissent des résultats plus rapides, mais elles sont généralement considérées comme moins sensibles et spécifiques que la culture cellulaire conventionnelle. De plus, elles ne conviennent pas à la détection de tous les troubles respiratoires. des virus; par exemple, le test antigénique des rhinovirus n’est pas possible, car il existe trop de sous-types et de cocirculation en même temps Bien qu’il ait été étudié dans plusieurs groupes de patients, le rôle des infections respiratoires virales comme cause de complication pulmonaire sévère traitement de cytoréduction ou en cours de SCT n’est pas encore clarifié et peut avoir été sous-estimé dans des études antérieures, en particulier dans des études qui ont reposé sur la culture virale.Le PCRR, soit en format unique ou multiplex, s’est avéré être une méthode extrêmement spécifique et sensible. Dans notre hôpital, des techniques de RT-PCR ont été mises au point pour détecter les virus respiratoires suivants: virus parainfluenza -, RSV, rhinovirus, virus grippaux A et B , entérovirus et coronavirus. , nous avons étudié la valeur de la PCR pour la détection des infections virales respiratoires chez les adultes atteints de cancer hématologique qui A également eu des signes de pneumonie pour établir le rôle des virus respiratoires chez ces patients

Patients et méthodes

Lasma pneumoniae, espèces de Chlamydia, espèces de Legionella et pathogènes des virus respiratoires Les échantillons de BAL et les écouvillons de NT ont ensuite été analysés à l’aide de techniques PCR pour la détection des virus respiratoires, la prophylaxie de l’infection et les mesures de prévention des infections. & gt; jours ont reçu une prophylaxie antibactérienne avec mg de ciprofloxacine administré par voie orale deux fois par jour et prophylaxie antifongique administrée par voie orale avec des comprimés d’amphotéricine B mg fois par jour et fluconazole mg une fois par jour Le régime antimicrobien a été poursuivi jusqu’à ce que le nombre de granulocytes a augmenté à & gt; × cellules / L Pour la prévention de la bactériémie causée par les streptocoques α-hémolytiques, les patients recevaient de la clindamycine mg fois par jour alors qu’ils présentaient une neutropénie en cas de cytarabine à forte dose ⩾ mg / m Les patients sous SCT recevaient la céphalothine par voie intraveineuse neutropénie Les patients qui ont subi un TCS allogénique ont reçu régulièrement du valacyclovir mg deux fois par jour et du cotrimoxazole une fois par jour pendant les premiers mois après la transplantation. En outre, les patients ayant eu un résultat positif au test de cytomégalovirus pp pendant les premiers mois ont subi un TCS allogénique. traitement préemptif avec ganciclovir Les patients hospitalisés ont été soignés dans des chambres individuelles avec entrée gratuite pour le personnel et les visiteurs. Le lavage des mains soigneux et l’utilisation d’aliments faiblement microbiens ont été les seules mesures préventives utilisées pour ces patients. hôpital acquis si les symptômes se sont développés ⩾ jours après l’admissionDiagnostic m éthodes pour la détection de routine des agents pathogènes des virus respiratoires Des prélèvements nasopharyngés et de la gorge, placés dans le même milieu de transport viral, et des échantillons de BAL placés dans un tube contenant le milieu de transport du virus ont été obtenus pour la culture virale; Le matériel a été divisé: une partie a été congelée et stockée à-° C pour une analyse plus poussée par PCR, et une autre a été directement utilisée pour la culture virale. ont été réalisées en inoculant HEp-C, R-HELA et des cellules t-MK du rein de singe tertiaire avec μL de chaque échantillon clinique pour la détection des virus respiratoires adénovirus, virus parainfluenza, virus RSV, virus de la grippe et picornavirus. En cas de cultures positives, le virus a été identifié par immunofluorescence avec des anticorps monoclonaux commerciaux Dako Imagen pour les virus grippaux A et B, RSV, virus parainfluenza et adénovirus Les rhinovirus ont été distingués des entérovirus par des tests de labilité aux acides. a été réalisée après – jours de culture, généralement avant qu’un effet cytopathique puisse être observé microscopie par immunofluorescence qui a utilisé vi Dako Imagen a été utilisé pour détecter le VRS, les virus parainfluenza, les virus grippaux A et B et les adénovirus. Seuls des échantillons sériques appariés ont été utilisés pour la détection sérologique des maladies virales respiratoires, et un diagnostic positif a été défini comme une augmentation La sérologie a été utilisée pour le RSV, la grippe A et B, le virus parainfluenza et l’adénovirus. En outre, le test d’immunofluorescence indirecte a été utilisé pour détecter l’extraction du VRS et de l’influenza A et BRNA à partir d’échantillons cliniques. PCR PCR nichée Une PCR a été réalisée pour détecter les virus grippaux A et B, les virus parainfluenza, les picornavirus rhinovirus et les entérovirus, RSV et les coronavirus sur les échantillons de BAL stockés obtenus chez tous les patients et sur les écouvillons NT obtenus chez ces patients; les tampons NT ont été obtenus dans la semaine des BALPrimers ont été obtenus de la littérature ou sélectionnés à partir GenBank sur les régions conservées des gènes de la protéine matricielle pour le virus influenza A, du gène hémagglutinine pour le virus influenza B , la région non codante les picornavirus , la protéine nucléocapside pour RSV A et B, l’hémagglutinine-neuraminidase glycoprotéine pour parainfluenza – , et la protéine nucléocapside pour coronavirus E et OC extraction d’acide nucléique a été réalisée à partir de μL de matériel patient conformément à la méthode de Boom et al Pour toutes les réactions PCR, une RT-PCR en tube a été suivie par une PCR nichée, essentiellement comme décrit par Nijhuis et al Les modifications de cette méthode ont consisté en l’optimisation de chaque réaction PCR séparée par dilution en série de Concentrations de MgCl et d’amorce La PCR a été réalisée sur un thermocycleur PE ABI Les rhinovirus ont été identifiés par digestion par BglI des amplicons RT-PCR de picornavirus Les produits de PCR ont été visualisés sur une n Gel d’agarose coloré au bromure d’éthidium par l’utilisation de l’éclairage ultravioletAnalyse statistique Les statistiques descriptives ont été exprimées en valeurs médianes χ Une analyse a été effectuée pour déterminer le degré de signification entre les diverses variables

Résultats

Caractéristiques du patient Les caractéristiques démographiques, la maladie sous-jacente, le traitement de conditionnement, l’utilisation prophylactique et l’état immunologique des patients sont présentés dans le tableau La majorité des patients présentent des signes et symptômes de maladie respiratoire Fièvre chez [%] des patients ], et l’essoufflement en [%] étaient les symptômes les plus fréquents. Dix% des patients ont développé des signes et des symptômes de pneumonie au moment de l’hospitalisation et% des patients ont développé une pneumonie communautaire. Vingt-huit% des patients avaient subi une TSC; la durée médiane de la transplantation jusqu’au début des symptômes de la maladie respiratoire était de plusieurs mois, mois. Vingt-six pour cent des patients ont développé une pneumonie pendant la saison hivernale octobre-mars

Tableau View largeTélécharger la lameCaractéristiques et résultats des adultes atteints d’un cancer hématologique pour lesquels des anomalies étaient visibles sur une radiographie thoraciqueTable View largeTélécharger la lameCaractéristiques et issues des adultes atteints de cancer hématologique pour lesquels des anomalies étaient visibles sur une radiographie thoraciqueDétection des virus respiratoires Par culture, test antigénique, ou les deux, des virus respiratoires ont été identifiés chez des patients, dont des VRS, des rhinovirus et des virus grippaux A. Les mêmes virus respiratoires ont été détectés par RT-PCR nichée Un des patients a eu une infection par un virus respiratoire deux fois. Le patient, qui était encore hospitalisé à l’hôpital, a développé une pneumonie nosocomiale une semaine plus tard, à la suite d’une grippe A confirmée par la culture. PCR dans une autre table de patients

Tableau View largeTélécharger une diapositive Détection de virus respiratoires par culture, analyse antigénique, ou par PCR, d’échantillons sérologiques appariés et d’échantillons de lavage broncho-alvéolaire ou d’écouvillons naso-naphtaux NTTable View largeTélécharger une diapositiveDétection de virus respiratoires par culture, test antigénique ou les deux et par PCR d’échantillons de sérum appariés et d’échantillons de lavage broncho-alvéolaire ou d’écouvillonnages naso-narinaires NTUn patient a eu une double infection avec le rhinovirus et le virus parainfluenza Au total, les virus respiratoires ont été détectés par PCR en% des patients détectée par culture, test d’antigène, ou les deux P & lt; Des échantillons sériques appariés étaient disponibles chez les patients Les tests sérologiques ont montré une augmentation du titre d’anticorps IgG spécifique du VRS chez les patients seulement et une augmentation du titre d’adénovirus chez les patients seuls. Un prélèvement NT combiné a été obtenu chez des patients dans la semaine de l’échantillon BAL Chez les patients atteints d’une maladie virale respiratoire pour lesquels des échantillons de NT et de BAL étaient disponibles, les résultats RT-PCR nichés sur NT ont toujours donné les mêmes résultats que les échantillons LBA. Autres causes de pneumonie Chez les patients%, aucune cause de pneumonie n’a été trouvée Des virus pathogènes respiratoires ont pu être détectés chez les patients% En% des patients chez lesquels un virus pathogène respiratoire a été détecté, une autre cause d’infection pulmonaire ou de lésion pulmonaire était cliniquement probable Deux de ces patients présentaient une pneumonie à la fois bactérienne et respiratoire. le virus Staphylococcus aureus et le rhinovirus chez un patient, et Haemophilus influenzae et le rhinovirus chez l’autre; Un autre patient avait une maladie lymphoproliférative post-transplantation avec atteinte pulmonaire après avoir reçu une greffe de cellules souches provenant d’un donneur apparenté non apparenté. en association avec une infection à entérovirus Chez le patient, un coronavirus a été détecté en plus d’une bronchiolite oblitérante. Quatre% des patients ont eu une pneumonie probablement causée par des patients ou des patients. On a isolé des espèces Enterobacter, Pseudomonas, H influenzae et Stenotrophomonas maltophilia. Patients Un total de patients% a été prouvé chez des patients ou probable dans une infection pulmonaire avec des champignons Cinq patients avaient d’autres causes de maladie pulmonaire Un patient avait une maladie lymphoproliférative post-transplantation associée au virus Epstein-Barr progressive avec atteinte pulmonaire après avoir reçu une greffe de cellules em provenant d’un donneur apparenté non apparenté; les patients avaient une bronchiolite oblitérante; un autre patient a eu une pneumonie à cytomégalovirus; et le patient a développé une lésion pulmonaire toxique après la transplantation

Table View largeDownload slideCauses d’anomalies pulmonaires chez les patients adultes atteints de malignité hématologiqueTable View largeTexte de lectureCauses d’anomalies pulmonaires chez les patients adultes atteints de tumeurs malignes hématologiquesTreatment Deux des patients atteints de pneumonie RSV ont été traités par ribavirine en aérosol fois par jour, pendant un minimum de jours. Les deux patients ont également guéri d’une pneumonie à VRS, mais sans administration de ribavirine. Un patient est décédé. Ce patient avait contracté une pneumonie à VRS lors d’une récurrence de la ribavirine. une leucémie myéloïde aiguë peu de temps après avoir reçu une greffe de cellules souches allogéniques provenant d’un donneur apparié non apparenté; Le patient n’a pas reçu de traitement, car le diagnostic a été posé par un résultat PCR positif pour le RSV seulement après décès. Comparaison entre les patients avec pneumonie avec ou sans virus respiratoire Les patients avec pneumonie provoquée par un virus respiratoire ont été comparés avec ceux ayant une pneumonie non provoquée par un virus respiratoire en ce qui concerne les caractéristiques suivantes: maladie sous-jacente, traitement, statut immunitaire, utilisation d’immunosuppresseurs, signes et symptômes, type d’échantillon obtenu, présence de maladie respiratoire nosocomiale ou acquise dans la communauté, temps de transplantation et Il n’y avait pas de différence significative dans les paramètres entre les groupes, bien qu’il semble y avoir une tendance vers plus de patients masculins, l’utilisation d’immunosuppresseurs, et la présence de neutropénie dans le groupe de patients qui ont eu une pneumonie qui était pas causée par un virus respiratoire La majorité [%] des cas de virus respiratoire La pneumonie associée au S est survenue durant la saison hivernale d’octobre à mars, tandis que la pneumonie sans détection du virus respiratoire a été répartie également pendant toute l’année [%] des cas survenant en hiver contre [%] cas en été

Discussion

Les données de notre étude sont cohérentes avec celles des études précédentes qui ont montré que le VRS est le virus respiratoire le plus répandu chez les personnes souffrant de pneumonie associée au virus respiratoire. Le taux de mortalité dans notre étude, Des virus grippaux et parainfluenza ont également été signalés fréquemment chez des patients immunodéprimés pendant les périodes d’apparition de ces virus respiratoires dans la communauté En particulier, l’infection par le virus parainfluenza peut être une cause importante de pneumonie potentiellement mortelle chez les patients L’incidence et la sévérité de la pneumonie chez les patients immunodéprimés provoqués par le virus de la grippe ont varié dans plusieurs études. Dans une étude , la grippe a été isolée chez% des personnes qui ont subi un traitement de leucémie. SCT et qui avait une maladie respiratoire aiguë, et il avait été compliqué par une pneumonie chez% de ces patients; le taux de mortalité associé à la pneumonie était de% dans cette étude D’autres chercheurs ont conclu que le virus de la grippe A chez les patients immunodéprimés occasionnellement cause de graves complications, et qu’il est souvent léger et spontané Nous avons trouvé des patients atteints de pneumonie Les rhinovirus ont également été identifiés comme des agents pathogènes susceptibles d’infecter les voies respiratoires inférieures. Ghosh et al ont décrit des cas d’infections associées aux rhinovirus dans les myélosupprimés. Dans cette étude, les rhinovirus ont été détectés au moyen de méthodes conventionnelles D’intérêt, avec l’utilisation de diagnostics moléculaires, nous avons documenté une implication accrue de% de rhinovirus dans les virus. pneumonie associée, indiquant que la rhinoviruse s peut jouer un rôle sérieux en tant que cause de pneumonie chez les patients immunodéprimésNous avons détecté un coronavirus dans un échantillon obtenu chez un de nos patients immunodéprimés Notre observation est en accord avec les résultats d’une autre étude qui a démontré qu’une pneumonie causée par un coronavirus survient chez un patient Nous avons également analysé nos échantillons pour la présence d’entérovirus, bien que les voies respiratoires inférieures ne soient pas le site habituel d’une infection à entérovirus. Cependant, chez les patients immunodéprimés avec pneumonie, présence d’entérovirus dans le BAL Ces résultats ont été confirmés dans notre propre étude, dans laquelle les patients ont révélé la présence d’un entérovirus et ont ainsi démontré que ces infections devraient être considérées comme une cause de pneumonie chez les patients gravement immunodéprimés. Bien qu’une méthode de détection d’adénovirus par PCR a été décrit ailleurs , nous Nous avons trouvé une augmentation du titre sérique d’adénovirus chez les patients. Aucun adénovirus n’a été détecté par culture standard ou détection d’antigène; Une PCR générique pour l’infection adénovirale n’était pas encore disponible dans notre laboratoire. Il existe encore quelques limites à prendre en compte lorsque la PCR est utilisée comme outil de diagnostic des virus respiratoires. Premièrement, nous ne pouvons exclure complètement la contamination de l’échantillon BAL des voies respiratoires supérieures. Comme indiqué précédemment, nous avons trouvé% concordance entre les résultats de PCR pour les échantillons BAL et NT Ainsi, nous ne pouvons pas exclure la possibilité de contamination Cependant, cette incertitude est intrinsèquement liée à l’utilisation de BAL Deuxièmement, nous ne pouvons pas exclure la possibilité de résultats PCR positifs Ayant peu de signification clinique, car les patients gravement immunodéprimés sont connus pour excréter le virus pendant de longues périodes Par conséquent, la signification exacte d’un résultat PCR positif doit encore être déterminée dans des études prospectivesParce que différents agents antiviraux sont maintenant disponibles ou en cours de développement des infections par le VRS, le virus de la grippe A et les rhinovirus , il est important de m’améliorer Une méthode rapide et sensible pour la détection des virus respiratoires est essentielle pour mettre en œuvre des mesures rapides, à la fois pour commencer le traitement le plus tôt possible chez les patients qui sont à risque de développer une pneumonie causée par des maladies respiratoires chez les patients immunodéprimés. Nous avons montré que la PCR pouvait être un outil important pour atteindre cet objectif. En conclusion, nous avons montré que les techniques de diagnostic moléculaire augmentent significativement le taux de détection des virus respiratoires chez les patients atteints de cancer hématologique et de pneumonie, par rapport aux méthodes traditionnelles Cependant, des études de surveillance prospective sont encore nécessaires pour mieux établir la valeur clinique de ces techniques