Impact de la stéréochimie absolue sur les activités antiangiogéniques et antifongiques de l’itraconazole

ont rapporté que l’itraconazole (Figure 1) (1), un médicament antifongique, inhibe puissamment la prolifération in vitro des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HU VEC) et l’angiogenèse in vivo.1 La cible responsable de l’activité antifongique de l’itraconazole est la lanostérol 14 α -déméthylase (14DM), une enzyme clé impliquée dans la biosynthèse de l’ergostérol, nécessaire à l’intégrité de la membrane cellulaire fongique.2 Cependant, le rôle du 14DM humain dans l’inhibition de l’angiogenèse par l’itraconazole reste incertain.La faible corrélation entre l’inhibition du 14DM humain et l’activité antiangiogénique de plusieurs médicaments antifongiques puissants azolés structurellement apparentés implique qu’une autre cible moléculaire primaire pourrait être responsable de l’activité antiangiogénique de l’itraconazole avec une contribution partielle de 14DM.1,3,4 1Structures des huit diastéréoisomères d’itraconazole issus de trois centres stéréogéniques numérotés 2, 4 et 2 &#x02032 ;. La désignation cis indique que les deux substituants (dans les boîtes bleues) sont du même côté du cycle 1,3-dioxolane, tandis que le … Itraconazole contient trois centres chiraux, donnant lieu à un total de huit stéréoisomères. Le cycle dioxolane abrite deux centres chiraux, tandis que le troisième est marqué 2 ′ réside sur la chaîne latérale sec-butyle ajoutée à l’anneau de triazolone (figure ​ (figure1) .1). En tant que médicament antifongique, l’itraconazole est administré dans des formulations cliniques sous la forme d’un mélange 1: 1: 1: 1 de quatre cis-stéréoisomères (1a & d02212; d) .5 Bien que l’activité antifongique6 et le métabolisme5 des stéréoisomères cis individuels de l’itraconazole , l’activité des stéréoisomères trans, 1e − h, n’a pas été révélée à ce jour. De plus, l’activité antiangiogénique de l’itraconazole n’a été examinée sous aucune de ses formes stéréochimiquement pures. Notre effort antérieur se limitait à la synthèse et à la détermination de l’activité anti-angiogénique des mélanges épimériques de 4R- et 4S-cis-itraconazole.1 Explorer systématiquement l’effet de la stéréochimie absolue à chaque centre chiral de l’itraconazole sur l’activité antifongique et antiangiogénique, nous avons synthétisé tous les huit stéréoisomères et comparé leurs activités antiangiogéniques et antifongiques. Nous avons commencé la synthèse totale en réduisant le groupe nitro dans N- (4-méthoxyphényl) -N &#x02032 ;-( 4-nitrophényl) -pipérazine 2 (Schéma 1 ) 1 en utilisant une hydrogénation par transfert catalysée par palladium. Au lieu du formiate d’ammonium que nous avions utilisé dans notre synthèse précédente, l’utilisation de l’hydrazine comme source d’hydrogène7 a produit des rendements beaucoup plus élevés d’aniline 3. La réduction du groupe nitro catalysée par le palladium a été obtenue avec un meilleur rendement Sans autre purification, le groupe amino en 3 a été transformé en triazolone via les intermédiaires phénylcarbamate et semicarbazide.8 Une petite quantité d’acide acétique a été ajoutée pour faciliter la cyclisation du semicarbazide avec l’acétate de formamidine. à une température plus basse que d’habitude pour ce type de fermeture de cycle, minimisant ainsi les réactions secondaires.9 La stéréochimie au 2 ′ position dans 1a − h a été hérité de la matière de départ optiquement pure, (R) – (−) – 2-butanol (5a) ou (S) – (+) – 2-butanol (5b). Le tosylate chiral 6a ou 6b a été obtenu avec un rendement presque quantitatif en faisant réagir 5a ou 5b avec du chlorure de tosyle en présence de triéthylamine et de DMAP. Pour obtenir une N-alkylation stéréospécifique de la triazolone 4 par déplacement de tosylate de 6a ou 6b, l’abstraction de protons de l’azote de triazolone a été réalisée en utilisant du carbonate de potassium conjointement avec 18-crown-6. Une telle application d’éthers couronnes est connue pour améliorer la nucléophilie de l’anion azote en formant des paires d’ions libres.10 En plus d’entraîner la réaction à température ambiante, ceci a évité une réaction SN1 potentielle et a minimisé la réaction d’élimination de 6a ou 6b. Une inversion propre de SN2 conduisant à 7a ou 7b sous une forme énantiomériquement pure a été documentée auparavant.11,12 Le résultat stéréochimique souhaité à cette étape de notre synthèse a également été confirmé plus tard par une analyse par chromatographie liquide haute performance chirale (HPLC) de 1a et 1b (tableau 1 et informations de support). L’élimination du groupe méthyle par chauffage de 7a ou 7b dans du HBr aqueux concentré à 110 ° C a donné 8a ou 8b contenant un phénol libre prêt pour le couplage final.8 Schéma 1 Synthèse de huit stéréoisomères d’ItraconazoleTable 1Chrial Analyse HPLC Données et rotation optique de l’itraconazole Stéréoisomères La cétalisation du cycle 1,3-dioxolane dans 11a & d; a été réalisée par une cétalisation assistée par un acide de 2,2 &#x02032 ;, 4 ′ -trichloroacétophénone 9 avec du tosylate de glycéryle optiquement pur 10a ou 10b.10. Alors que la stéréochimie à C-4 dans 11a − d émane du matériau de départ chiral 10a ou 10b, C-2 est le nouveau centre chiral qui est créé pendant la cétalisation et donc numéroté en bleu. Le rapport des diastéréoisomères cis et trans 11a / 11c ou 11b / 11d est dicté par les effets stériques, et en fait, une prépondérance du cis-dioxolane a été observée. Le diastéréoisomère cis (11a ou 11b) 13 a été séparé du diastéréoisomère trans (11c ou 11d) et purifié davantage par l’approche double de recristallisation bien établie10. Cependant, à ce jour, parmi les diastéréoisomères trans, seulement 11c pouvaient être tracés dans le littérature à une citation fugace, et étonnamment, 11d est inconnu.Après une analyse méticuleuse par chromatographie sur couche mince, on a constaté que les sels de tosylate du diastéréoisomère trans restaient principalement dans la solution d’acétate d’éthyle pendant le procédé de purification du produit cis. En faisant passer une colonne à gradient (50: 1 → CH2Cl2-acétone 5: 1), 11c a été isolé à partir de 11a et d’autres produits secondaires avec une pureté suffisante pour la caractérisation par RMN. De même, 11d pur a également été obtenu. Les spectres RMN 1H (Figure 2A, B) 2A, B) illustrent les différences évidentes non seulement dans la région aromatique (7,0 et 8,5 ppm) mais également dans la région aliphatique (3,4 − 4,8 ppm), provenant de différentes conformations de cycle 1,3-dioxolane dans les diastéréoisomères eis et trans. Figure 21H et RMN 13C des intermédiaires de 1,3-dioxolane 11a et d. (A) RMN 1H pour cis-11a et 11b. (B) 1H RMN pour trans-11c et 11d.Avec les blocs de construction en main, le déplacement du groupe O-tosyle en 11a & d; avec l’oxygène phénolique en 8a, b dans des conditions basiques a fourni des produits finaux 1a &#x02212 h.8 Parce que les centres chiraux sur le cycle 1,3-dioxolane sont bien séparés du troisième centre chiral sur la chaîne latérale sec-butyle, il n’est pas surprenant que les diastéréomères cis puissent être bien distingués des diastéréoisomères trans par RMN , alors que tous les stéréoisomères cis la et d ou les stéréoisomères trans 1e et # 122212; h présentaient des spectres RMN 1H et 13C identiques. Afin de fournir un soutien supplémentaire pour la synthèse et la purification des huit stéréoisomères, la rotation optique et le profil HPLC chirale de chaque stéréoisomère ont été mesurés (Tableau 1 et Informations Complémentaires) .Après avoir confirmé la qualité de tous les stéréoisomères, la puissance de chaque stéréoisomère contre les HUVEC la prolifération et la croissance fongique ont été déterminées (tableau 2). Les HUVEC ont été incubées avec le médicament ou le véhicule seul pendant 24 h puis ont été puisées pendant 6 h avec de la [3H] -thymidine, dont l’incorporation a été prise comme une lecture de la prolifération cellulaire. L’inhibition de la croissance fongique a été testée en incubant cinq souches de levure avec des dilutions en série de 2 fois de chaque stéréoisomère pendant 30 h selon la souche (voir les méthodes dans l’information de support) puis en mesurant la DO600 de la culture à quantifier. croissance. La concentration minimale capable d’inhiber la croissance de 80% (MIC80) a été déterminée.Tableau 2Potence des stéréoisomères d’itraconazole dans des dosages biologiques L’influence de la stéréochimie sur l’inhibition de la prolifération des HUVEC par l’itraconazole était mineure. La différence de puissance entre 1a et 1f, les stéréoisomères les plus et les moins puissants, respectivement, n’était que légèrement supérieure à 4 fois. Le déterminant stéréochimique le plus pertinent de la puissance dans les cellules HUVEC était la configuration du cycle dioxolane, les diastéréoisomères cis présentant une puissance supérieure à la série trans de plusieurs fois. Nous notons que le diastéréoisomère cis-4R est légèrement plus puissant que l’isomère cis-4S. Ceci est contraire à notre précédent rapport1. Après avoir soigneusement examiné les étapes individuelles de la synthèse précédente, il semble que les centres stéréochimiques aient été mal attribués. Par conséquent, nous souhaitons également corriger notre précédent compte avec les affectations stéréochimiques et les données de dosage correspondantes dans cette lettre. Contrairement aux HUVEC, la puissance de l’itraconazole contre la prolifération fongique était fortement influencée par la stéréochimie (Tableau 2). Nous avons observé une différence de puissance allant jusqu’à 32 fois entre les stéréoisomères dans une souche fongique. Dans quatre des cinq souches testées, les stéréoisomères les moins puissants d’une marge d’au moins 4 x 3222 étaient deux des isomères trans, 1 g et 1 h. D’un autre côté, l’autre paire de transe 1e et 1f était à peu près aussi puissante que les diastéréoisomères cis (la − d). L’exception était Cryptococcus neoformans dans lequel 1e et 1f étaient deux fois moins puissants que 1g et 1h et 32 ​​fois moins puissants que le meilleur inhibiteur.Dans le cas des antifongiques azolés contenant du dioxolane comme l’itraconazole, le kétoconazole et le terconazole, il a On a noté depuis longtemps que les paires diastéréoisomères cis présentent une puissance antifongique beaucoup plus élevée sur leurs homologues trans, et ainsi, pour des raisons d’efficacité, elles ont été utilisées cliniquement sous forme de mélanges de diastéréoisomères cis. Des études d’amarrage effectuées sur la base de la structure cristalline publiée fluconazole-MtCYP51 (appelée 14DM pour l’enzyme humaine) ont fourni une explication à cet effet.14 Rupp et al. Ils ont conclu que la paire cis (2S, 4R et 2R, 4S) et une seule de la paire trans, à savoir le 2S, 4S-kétoconazole, se lient avidement à CaCYP51. , qui est en bon accord avec les valeurs IC50 rapportées des stéréoisomères du kétoconazole contre Candida albicans.16 Les activités antifongiques que nous avons mesurées pour les huit stéréoisomères de l’itraconazole contre les trois ascomycètes correspondent parfaitement au schéma observé avec le kétoconazole.Il est possible que les enzymes CYP51 des ascomycètes lient mal le 2R, 4R-itraconazole, alors que dans le cas des C. neoformans phylogénétiquement distants, ce scénario de liaison entre les paires de trans est tout à fait le contraire. Ceci peut également s’expliquer par l’expression d’une pompe d’efflux stéréosélective ou d’une enzyme catabolique dans cette souche. Pris ensemble, ces données indiquent que, contrairement à l’inhibition des HUVEC, la sensibilité de la croissance fongique à l’itraconazole n’est pas dictée par la configuration trans-cis du cycle dioxolane, mais par la stéréochimie absolue aux carbones 2 et 4. Le seul point commun que nous avons observé pour le rôle de la stéréochimie dans HUVEC et l’inhibition fongique était que la stéréochimie au 2 ′ En résumé, tous les diastéréoisomères cis qui composent l’itraconazole commercial présentaient une activité élevée à la fois dans l’inhibition des HUVEC et dans l’inhibition fongique conception. Tous les diastéréoisomères trans étaient moins puissants dans la prolifération des HUVEC que les diastéréoisomères cis. En revanche, une paire de diastéréoisomères trans, 1e et 1f, était à peu près aussi puissante que les diastéréoisomères cis en ce qui concerne l’activité antifongique contre quatre souches sur cinq. L’absence de corrélation entre les HUVEC et la sensibilité fongique aux stéréoisomères optiquement purs de l’itraconazole suggère que le 14DM humain n’est pas susceptible d’être la principale cible de l’activité antiangiogénique de l’itraconazole. En effet, nous avons récemment constaté que l’effet inhibiteur de l’itraconazole sur les cellules endothéliales résulte en grande partie de son inhibition du trafic de cholestérol à travers le compartiment lysosomal, conduisant à l’inhibition de la voie mTOR.17 Ce travail fournit des données indisponibles sur le rôle de la stéréochimie dans le la puissance de l’itraconazole contre une cible thérapeutique émergente pour ce médicament, l’angiogenèse. Nous avons démontré que les composés 1a et 1b possèdent le plus grand potentiel antiangiogénique et devraient donc être utilisés en tant que composés principaux pour l’optimisation de l’itraconazole comme médicament antiangiogénique.