Découverte de nouveaux inducteurs p53 à base d’isatine

La protéine p53

fonctions principalement

en tant que facteur de transcription spécifique de la séquence, 1 et il conduit à l’expression d’un grand nombre de gènes2 en réponse à divers stimuli.3 L’opinion actuelle est que p53, en plus de son rôle crucial

rôle dans les réponses anticancéreuses, 4 joue également

un rôle dans l’inflammation.5 L’atténuation

de l’activité p53 (fréquemment causée par des mutations ponctuelles ou une surexpression

de ses protéines régulatrices négatives) conduit à une prolifération cellulaire incontrôlée.P53 a un large réseau d’interactions protéiques et protéiques6 (PPI), et certaines des protéines qui interagissent sont

Cependant, parmi la grande variété d’IPP p53, seules quelques interactions interagissent

les protéines sont directement responsables de l’activité et de la stabilité de p53.

Par conséquent, émousser ces PPI liés p53 critiques a été montré

être une stratégie efficace pour le traitement du cancer.8 Il existe plusieurs méthodes pharmacologiques pour stimuler

antitumorale p53

activité: (a) les petites molécules (SM) responsables du stress génotoxique

exemple, doxorubicine); 7 (b) réactivateurs

de mutant p53, qui ramène la molécule p53 à la conformation de type sauvage; 9 et (c) les inhibiteurs de SM PPI qui bloquent l’ubiquitine

dégradation du protéasome de p53.8 Ce dernier

“ class ” des molécules semble être le plus prometteur

car il présente généralement des niveaux de toxicité plus faibles.

ci-dessus, p53 est soumis à une dégradation dépendante de l’ubiquitine,

et la principale ligase de l’ubiquitine E3 p53-spécifique est le double de la souris

minute (MDM2) protéine. Peut-être pas étonnamment, MDM2 est un important pharmacologique

cible. Fait important, contrairement à l’acétylation10 ou à la méthylation, l’ubiquitination dépendante de MDM2 de p53 sur plusieurs

résidus de lysine à son extrémité C-terminale déstabilise significativement la protéine10. Ces dernières années, le MDM2 a été reconnu

la protéine critique à cibler pour la stabilisation de p53.11 La protéine p53 peut être structurellement divisée en

quatre domaines:

la région N-terminale qui comprend deux domaines de transactivation (TAD),

la région riche en proline, le domaine central de liaison à l’ADN, et

la tétramérisation C-terminale et le domaine de régulation.12 Les TAD p53 sont l’interface principale pour l’interaction

avec le réglementaire

protéine MDM2. La partie α -hélique de TAD1 (résidus clés Phe19,

Trp23, et Leu26) au sein de la protéine p53 interagit avec MDM2 par liaison

à sa poche hydrophobe N-terminale. La partie liée à p53 de MDM2

est rigide, et sa structure résolue est largement utilisée dans l’amarrage moléculaire

études13. La plupart des inhibiteurs de MDM2

imiter la structure du TAD1 α -helix14 et donc former les mêmes contacts intermoléculaires

avec la poche hydrophobe MDM2 comme p53 d’origine. Une alternative

concept de peptides agrafés a été montré pour être une stratégie réussie

dans les tentatives d’inhiber MDM2.15 Nutlin-3

est l’inhibiteur SM le plus étudié de l’interaction MDM2 – p53;

il a été examiné par des expériences in vitro et in vivo (16). Nombreuses

Les études NMR17 et X-ray18 ont spécifié la pose de liaison et les détails de ses interactions

avec MDM2. Nutlin-3 était capable de réactiver p53 d’une manière non toxique

dans les essais cliniques.19 À ce jour, beaucoup de Nutlin

des dérivés avec des affinités plus élevées pour MDM2 ont été développés. Isoindolinones

sont des dérivés d’une classe prometteuse “ ” d’inhibiteurs

montrant une activité in vivo et in vitro.20 Les benzylidèneindoline-2-ones ont récemment

présentés en tant qu’inhibiteurs de PPI de MDM2-p53 qui montrent dans l’activité de cellulo.21 Plus d’informations détaillées

à propos des inhibiteurs de l’IPP est présenté dans la revue récemment publiée.22 L’isatin (1H-indole-2,3-dione)

échafaudage (benzylidèneindoline-2-one

analogue) est largement utilisé dans les études de découverte de médicaments.23 Des dérivés d’isatin pipérazine N-substitués ont été rapportés

comme inhibiteurs sélectifs de l’aldéhyde déshydrogénase dans

dosages in vitro, 24 et le cristal

structures de complexes de protéines et de ligands ont validé le mécanisme

de leur action. Les analogues de la pipéridine montrent une activité inhibitrice

une autre classe de protéines métaboliques, les carboxylesterases.25 isatines N-alkylées ont été récemment décrits

en tant qu’inhibiteurs de l’activité de la caspase-3.26 Isatin-benzothiazole

Les dérivés de base de Schiff ont montré une activité anticancéreuse dans la tumeur du sein

lignées cellulaires.27 Ici, nous signalons

découverte de l’isatine Mannich et de la base de Schiff

dérivés (IMSBD) qui activent le facteur de transcription p53. Celles-ci

les composés ont été identifiés par criblage in silico

(Tableau S2), et leurs activités ont été validées en cellulo en utilisant un ostéosarcome osseux humain U2OS épithélial

la lignée cellulaire, qui exprimait de façon stable un fluorescent vert amélioré dirigé par p53

rapport de protéine (EGFP). Nous avons virtuellement

projeté la bibliothèque interne de 38 000 composés

disponible à l’Institut technologique de Saint-Pétersbourg. Une analyse

des données d’affinité avec l’inspection visuelle nous a permis d’identifier

une liste des inhibiteurs potentiels de l’IMSBD de MDM2-p53 PPI. Parce que le identifié

Les IMSBD peuvent exister dans deux états isomériques, 28 ils ont été traités comme des isomères E et Z séparés. Certains des IMSBD étaient peu solubles, tandis que d’autres

avait une faible activité inhibitrice et des niveaux élevés de cytotoxicité

Les dérivés de base de benzamide isatinés de Schiff de N-substitués ont montré significatif

les niveaux d’activation de p53 (Tableau 1) accompagnés d’une faible toxicité). Les composés identifiés

représenter une combinaison de Mannich29 et

Les bases de Schiff connues pour avoir tendance

pour l’hydrolyse gale. Par conséquent, nous avons analysé séparément deux différents possibles

réactions d’hydrolyse (figure S7) de IMSBD4

en utilisant la spectrométrie UV – Comme vu dans la figure

S6, incubation de la base d’isatine Mannich pendant 12 h à pH 7,5

et 37 ° C conduit à son hydrolyse presque complète. En revanche,

la base d’isatine Schiff présentait un taux d’hydrolyse beaucoup plus faible.

Ainsi, nous avons prédit que même si les composés sélectionnés subissent

hydrolyse, ils exercent encore leurs fonctions biologiques en tant que non-N-substitué

Schiff bases.Importantly, nous avons constaté que les composés se lient

avec BSA, qui est

abondamment présent dans le sérum. L’interaction des composés avec les deux

BSA et MDM2 pourraient également empêcher ces composés de subir une hydrolyse.

Par exemple, Kimble-Hill et al.24 ont rapporté

cristallisation réussie de la base de Mannich non hydrolysée (N – [(1-pipérazinyl) méthyl] -isatine) avec la protéine ALDH3A1

en utilisant le même pH et le même système tampon dans le test de cristallisation que

nous avons utilisé dans nos études d’hydrolyse. Ainsi, le plus grand pic de

les spectres UV – vis dans les milieux de culture que dans le tampon

(Figure S6) peut être expliqué par l’effet

de la liaison BSA.Nous avons analysé la capacité des deux isomères ISBD

ancrer à la liaison p53

poche de MDM2. Les (E) -ISBD ancrés à la liaison p53

poche avec plus faible Δ G que la forme Z d’environ 1 kcal / mol. Comme on le voit sur la figure ​ Figure11, les formes isomères (E) -ISBD2

interactions principalement hydrophobes avec le site de liaison de MDM2 p53 (Leu

poche, π – π interaction d’empilement avec His96 et

Tyr100). L’affinité calculée de (S, E) -ISBD1 pour la poche de liaison à p53 de MDM2 est un fois plus faible en unités Ki que la valeur correspondante pour ISBD2.

Nous proposons que les ISBD identifiés puissent agir comme p53 α -helix

mimétique (Figure ​ Figure11),

par lequel le cycle phényle de ISBD2 recouvre le résidu Phe19, et le

le noyau d’isatine recouvre le Leu26 hydrophobe de l’hélice p53 α

De plus, le carbone aliphatique méthylé dans (S, E) -ISBD1 modifie la conformation du ligand,

provoquant l’anneau de phényle pour superposer le résidu Trp23. Figure 1 Représentation superposée

des poses ancrées de ISBD2 (bleu)

et ISBD1 (rose) avec le p53 TAD1 α -helix (cyan). Figure 2 Représentation schématique du système de test

contenant cinq p53

éléments de réponse.Une des limitations majeures de l’activation de p53

ISBDs est la présence

de l’interconversion E-Z, qui

abaisse l’affinité de liaison globale à MDM2. Comme indiqué précédemment, 28 ISBD cristallisent préférentiellement dans la configuration (E) mais se transforment en la forme (Z)

lorsqu’il est dissous. La topologie de la forme (Z) diffère

sensiblement à partir de celle du conformateur (E) (figure S10). Nous avons réalisé des expériences RMN 2D

sur IMSBD4 pour obtenir la relation

des concentrations en solution E-to-Z.

Les données spectrales (Supporting Information) confirment le rapport molaire (E-to-Z)

être 8: 1 dans le DMSO polaire (ε = 46,8) et dans le chloroforme moins polaire

(ε = 4,7). Nous suggérons que le rapport entre ces isomères reste

environ la même lorsqu’il est dissous dans un milieu de culture pour des études in vivo. Nous avons également confirmé la présence de la configuration E à l’état solide en résolvant le cristal

structure de IMSBD4 (Table S1 et Figure S2) .Pour valider nos prédictions in silico,

nous avons décidé

étudier l’effet des SM sur la stabilisation et l’activation de p53. À

À cette fin, nous avons développé un système de reportage basé sur les cellules utilisant le p53-positif

La lignée cellulaire U2OS (Figure ​ Figure 22). À la différence des modèles in vitro, cette approche est moins

sujettes à des signaux faussement positifs en raison de l’arrière-plan inférieur de la cible

effets. La lignée cellulaire résultante comporte un plasmide épisomique

contient la séquence codante EGFP sous le contrôle

de cinq éléments de réponse p53 répétés pris dans la région du promoteur

du gène p21, qui est la véritable cible de l’activité transcriptionnelle p53.

activation des SM (par exemple, inhibiteurs de PPI MDM2-p53),

le p53 cellulaire est stabilisé par la modification de l’acétylation.30 Par la suite, p53 lie les éléments de réponse

et déclenche la transcription du gène EGFP, dont le produit émet une fluorescence.

Par conséquent, l’efficacité de SM activant p53 a été mesurée indirectement

comme le nombre de cellules EGFP-positives. Comme le montre la figure ​ Figure33, la présence de EGFP-positif

les cellules (vertes) démontrent que IMSBD4

active la transcription p53-dépendante du rapporteur de l’EGFP.Figure 3Representative

image de la réponse de la lignée cellulaire U2OS-pLV au traitement

avec Nutlin-3 (2,5 μ M) (A) et IMSBD4 (2,5 μ M) (B) .Quantitativement, la puissance de

composés a été estimé comme le ratio

entre le pourcentage de cellules EGFP positives après traitement avec

IMSBDs (2,5 μ M, 48 h) et l’effet d’un bien caractérisé

inhibiteur non-toxique de MDM2, Nutlin-3. Les bases N-Mannich des ISBD substituées

avec N- (benzyl) benzamide démontré des niveaux plus élevés

d’activation de p53 que l’inhibiteur de Nutlin-3 témoin (Tableau 1). Activation EGFP et cytotoxicité

(Coloration de Hoechst) dans p53 + et p53 – les cellules traitées avec divers IMSBD sont présentées comme des rapports entre les

les effets des composés et les effets induits par le traitement par Nutlin-3,

qui ont été définis arbitrairement comme 1.Table 1EGFP Activation et

Cytotoxicité après

Traitement avec IMSBDsAs vu dans le tableau 1, différents IMSBDs activent p53 dans les cellules U2OS-pLV (tel que mesuré par

le nombre de cellules “ avec EGFP ”) à différents niveaux mais

sont toujours plus efficaces que Nutlin-3. Nous avons également mesuré

effet cytotoxique des SM en comptant le nombre de cellules ayant survécu

après le traitement. La cytotoxicité des IMSBD était claire et constante

plus élevé dans les cellules p53 + par rapport à p53 – cellules

(Tableau 1, comparez

deux dernières lignes), ce qui indique que ces effets dépendent de p53.

Le fait que la cytotoxicité de l’IMSBD soit supérieure à celle de Nutlin-3

suggère que ces composés peuvent avoir des cibles supplémentaires et / ou activer

la voie apoptotique p53, qui est mécaniquement différente de

la voie activée par Nutlin-3 dans ces cellules. La différence

en activité entre IMSBD2 – IMSBD6 n’est pas

significative (par rapport à IMSBD1), ce qui soutient l’hypothèse que

la base commune de Schiff est la partie active des IMSBD et que la variable

La base de Mannich n’a pas d’effet significatif sur l’activité des MS. Léger

les différences dans l’activité peuvent s’expliquer par les différences de

propriétés physiques (par exemple, logP et PSA) des IMSBD, tandis que la liaison

Les poses de l’ISBD et de l’IMSBD à MDM2 sont généralement similaires (Figure S9). Pour évaluer directement l’effet

d’IMSBD sur la stabilité de la

protéine p53, nous avons effectué un transfert de Western (WB), ce qui permet de mesurer

des niveaux intracellulaires de la protéine p53. Le représentant

Les données WB utilisant IMSBD4 sont représentées sur la figure ​ Traitement des cellules U2OS-pLV avec IMSBD4

pendant 12 h a entraîné une stabilisation p53 comparable à l’effet de

Nutlin-3 mais était moins prononcé que la doxorubicine (DOXO). Analyse de la figure 4WB

des niveaux de protéines p53 après traitement avec différents

composés.Nous avons également examiné les niveaux de

Expression MDM2 comme c’est la transcription

cible de p53, et le produit du gène MDM2 ubiquitine p53.31 Comme le montre la figure ​ Figure 44, bien que IMSBD4 augmente de manière significative

le niveau de p53, il a peu ou pas d’influence sur le niveau de protéines

de MDM2. En revanche, Nutlin-3 et Doxorubicine ont augmenté le niveau

de MDM2 dans des cellules U2OS-pLV. Cet écart indique également que les IMSBD

peut stabiliser p53 par un (des) mécanisme (s) différent (s) de celui (s) exercé (s)

par Nutlin-3. Par exemple, un analogue proche de l’ISBD, le 4-hydroxybenzylidèneindolin-2-one,

a été rapporté en tant qu’inhibiteur micromolaire de Polo-like kinase 4,

qui est indirectement impliqué dans la régulation de p53.32 Cependant, le mécanisme moléculaire exact de p53

la stabilisation nécessite une investigation supplémentaire. En utilisant des études silico et in vivo,

nous avons identifié plusieurs dérivés à base d’isatine qui affichent une forte

p53 effets stimulateurs. Basé sur la modélisation in silico,

nous supposons que ces nouveaux activateurs pharmacologiques de p53 peuvent perturber

le PPI entre p53 et MDM2. Cependant, d’autres études sont nécessaires

établir le mécanisme moléculaire précis de ce phénomène. | ​​n | aucun