Utilisation et évaluation des diagnostics moléculaires pour les études d’étiologie de la pneumonie

La phase de développement de PERCH nous a fourni le temps et les ressources nécessaires pour effectuer un examen complet de l’état actuel des diagnostics respiratoires. Ces efforts nous ont permis d’articuler le diagnostic de la pneumonie www.nizagara.net. PERCH, établir que les méthodes moléculaires seraient au cœur de notre stratégie de test et se concentrer sur une liste restreinte de plateformes candidates Ce processus a également mis en évidence les défis critiques dans la conception générale et l’interprétation des études d’évaluation diagnostique, en particulier dans le domaine des infections respiratoires. Bien que notre plate-forme finale de diagnostic moléculaire ait été finalement sélectionnée sur la base de considérations opérationnelles et stratégiques déterminées par le contexte spécifique de PERCH, notre revue a mis en évidence plusieurs défis conceptuels et pratiques dans le diagnostic respiratoire. des études de recherche sur la pneumonie

Le développement d’une stratégie globale de tests microbiologiques a été un principe fondamental dans la conception et la conception du projet PERCH En formulant l’approche la plus efficace pour le diagnostic respiratoire, nous avons déterminé qu’une plate-forme de diagnostic moléculaire multiplex serait une composante essentielle de notre approche Bon nombre des considérations techniques et opérationnelles rencontrées à travers ce processus se sont avérées pertinentes pour la conception globale du projet. Nous décrivons ici les défis théoriques et pratiques rencontrés dans l’évaluation et la sélection d’une plateforme moléculaire pour le diagnostic de pneumonie.

METHODES DE DIAGNOSTIC DE PNEUMONIE

Comme décrit ailleurs dans ce numéro , les preuves microbiologiques de l’infection doivent être considérées dans le contexte de plusieurs difficultés fondamentales rencontrées dans les diagnostics respiratoires, notamment l’absence fréquente d’accès au site d’infection, l’insensibilité des tests disponibles et les complexités pour déterminer si un pathogène détecté a un rôle causal dans la maladie Les exigences spécifiques de recherche de PERCH ont ajouté à ces contraintes, exigeant que notre stratégie de diagnostic exclue toute hypothèse antérieure concernant l’importance probable de pathogènes spécifiques; doit inclure une gamme complète de prélèvements des voies respiratoires, y compris un prélèvement ou un prélèvement sur les voies respiratoires supérieures, une expectoration induite, une aspiration pulmonaire, un lavage broncho-alvéolaire et un liquide pleural; doit être complet, mais réaliste; doit équilibrer de manière appropriée les exigences d’exactitude et d’efficacité; doit tenir compte à la fois des questions d’éthique clinique et de recherche; Pour commencer le processus de sélection, les chercheurs de PERCH ont effectué un examen approfondi du diagnostic microbiologique des infections respiratoires. En utilisant des données publiées et non publiées, ainsi que les expériences des utilisateurs et des développeurs, notre équipe a préparé un Nous avons évalué chaque catégorie d’analyse majeure, y compris la bactériologie traditionnelle et la culture virale, la détection directe d’antigènes et d’anticorps immunofluorescents et les tests d’acides nucléiques. Il était évident que les diagnostics moléculaires devraient faire partie des mélange d’outils diagnostiques requis pour répondre aux besoins des tests de détection des acides PERCHNucleic Les NADT présentent un certain nombre d’avantages par rapport aux autres plateformes diagnostiques pour l’évaluation des échantillons respiratoires Ils démontrent une sensibilité supérieure pour détecter les organismes fastidieux, moins viables ou présents seulement de petites quantités Les diagnostics moléculaires peuvent également être rapidement adaptés pour détecter les agents pathogènes émergents ou émergents et sont sensibles aux économies d’échelle telles que l’automatisation. Ils permettent également la détection simultanée de plusieurs cibles multiplexées, ce qui permet de tester par -infections Les méthodes NADT présentent moins de danger pour le personnel de laboratoire comparé à la culture, nécessitent généralement moins de temps comparé à la culture bactérienne et requièrent moins de capacité technique que la culture virale. Ces avantages ont été largement évalués dans la détection de plusieurs virus. et les bactéries des voies respiratoires et sont devenus l’outil de choix pour de nombreux agents difficiles à isoler Les plates-formes de diagnostic moléculaire ne sont pas sans inconvénients Le coût et la complexité demeurent des obstacles importants à l’adoption dans de nombreux laboratoires. contamination de laboratoire avec des produits amplifiés , en particulier si la procédure d’analyse nécessite l’ouverture du tube de réaction avant l’étape de détection de la cible Les mesures de limitation de la contamination nécessitent souvent un espace de laboratoire supplémentaire qui peut ne pas être disponible dans des conditions de ressources limitées. de la recherche diagnostique, des améliorations prometteuses dans l’automatisation et la vitesse, des dispositifs plus petits, une meilleure rentabilité et une meilleure détection des pathogènes émergents

EXAMEN DES DIAGNOSTICS MOLÉCULAIRES

L’accent mis sur les méthodes moléculaires pour la détection des pathogènes respiratoires a donné lieu à une grande variété de technologies potentielles à prendre en compte dans PERCH Tableau Polymérase Réaction en chaîne La technologie PCR est plus fréquente dans les sites de recherche du monde entier, peut être adaptée à diverses plates-formes. Plusieurs méthodes sont employées dans les dosages basés sur la PCR et offrent des avantages significatifs par rapport aux dosages à un seul pathogène en termes d’efficacité et de couverture pathogène. Les développeurs doivent surmonter des complexités considérables pour harmoniser les exigences de réaction de chaque cible individuelle et limiter Compétence potentielle entre les analytes Ces facteurs peuvent entraîner une diminution mesurable de la sensibilité par rapport aux tests single-plex Plusieurs techniques ont été développées pour traiter de tels facteurs, tels que les altérations des protocoles cycliques , les combinaisons d’amorces nichées et les concentrations , et l’utilisation de nucléotides non traditionnels D’autres technologies NADT, telles que l’amplification basée sur les séquences d’acides nucléiques et l’amplification isotherme à médiation en boucle, ont été utilisées pour la détection de pathogènes respiratoires, mais l’expérience du multiplexage est limitée. ]

tableau de suspension Luminex, MassTag, IBIS Capacité pour & gt; cibles en réaction Nécessite un équipement spécialisé; sensibilité réduite, en particulier avec des co-infections; nécessite généralement l’ouverture du tube de réaction [,, -,] Réseaux de phase solide Infiniti, Virochip Peut potentiellement détecter des milliers de cibles Nécessite des concentrations cibles plus élevées; équipement coûteux et réactifs [,,,] Mutliplex PCR en temps réel Fast Track Diagnostics Technologie largement utilisée; systeme ferme; fournit des informations sur la quantité et la qualité des capacités de multiplexage limitées dans chaque tube; équipement et réactifs coûteux [,,] Réseau de PCR en temps réel multiplex Uniplex Taqman Low-Density Array Aucune interaction entre les amorces cibles et les réactions; capacité pour & gt; cibles par échantillon L’échelle microfluidique réduit la sensibilité; équipement coûteux et réactifs Plate-forme Exemples disponibles dans le commerce Avantages Inconvénients Références sélectionnées Tableau de suspension en phase liquide Luminex, MassTag, IBIS Capacité pour & gt; cibles en réaction Nécessite un équipement spécialisé; sensibilité réduite, en particulier avec des co-infections; nécessite généralement l’ouverture du tube de réaction [,, -,] Réseaux de phase solide Infiniti, Virochip Peut potentiellement détecter des milliers de cibles Nécessite des concentrations cibles plus élevées; équipement coûteux et réactifs [,,,] Mutliplex PCR en temps réel Fast Track Diagnostics Technologie largement utilisée; systeme ferme; fournit des informations sur la quantité et la qualité des capacités de multiplexage limitées dans chaque tube; équipement et réactifs coûteux [,,] Réseau de PCR en temps réel multiplex Uniplex Taqman Low-Density Array Aucune interaction entre les amorces cibles et les réactions; capacité pour & gt; cibles par échantillon L’échelle microfluidique réduit la sensibilité; [1] Abréviation: PCR, réaction en chaîne de la polyméraseVoir LargeTechnologies pour la détection de cibles prennent une variété encore plus grande de formats Les anciennes méthodes incluent l’électrophorèse sur gel d’agarose, la transcription inverse et l’hybridation enzymatique et la capture oligonucléotidique enzymatique. Plus récemment, les plates-formes matricielles en phase solide et liquide sont devenues plus utiles pour la détection de cibles multiples. Les matrices en phase solide utilisent une variété de formats, typiquement en incorporant des oligonucléotides spécifiques à la cible sur une micropuce en verre ou en silicium. Des dizaines à des centaines de milliers de séquences amplifiées Plusieurs systèmes de diagnostic respiratoire ont été basés sur une technologie en phase liquide utilisant des microbilles de polystyrène Luminex [,, -,] ou spectroscopie de masse pour la discrimination des amplicons. de la PCR multiplexe, leur complexité, leur équipement spécialisé et leur bon démarrage De plus, ces plates-formes nécessitent généralement des étapes séparées pour l’amplification et la détection, augmentant à la fois la charge de travail et le risque d’erreur de l’opérateur ou de contamination par les amplicons. En outre, cette technique permet la quantification des agents pathogènes et l’évaluation de l’efficacité de la réplication. Comme pour la PCR conventionnelle, les tests multiplex en temps réel sont soumis à la compétition et à l’inhibition entre les amorces. les dosages sont également limités dans le nombre de produits de réaction qui peuvent être détectés en parallèle , bien que ce problème puisse être partiellement contourné en utilisant des réseaux de réactions en temps réel uniplexes à de très petits volumes pathogènes respiratoires ont été développés en utilisant uniplex et multiplex approches, b Les données sur les performances des versions commercialisées ne sont pas facilement disponibles. Les efforts de développement du NADT pour le diagnostic respiratoire ont porté sur la détection des virus, étant donné les avantages de ces techniques par rapport aux méthodes conventionnelles en termes de vitesse, de sensibilité et de polyvalence. classe de pathogènes Les approches multiplex pour la détection virale sont devenues plus fréquentes que les technologies ont été revues par [,,,] De plus, les NADT sont devenues l’étalon-or pour la détection de Mycoplasma pneumoniae et Chlamydophila pneumoniae . Les tests multiplex pour la détection de pathogènes bactériens plus traditionnels n’ont pas été étudiés aussi fréquemment dans les échantillons respiratoires, principalement parce que les techniques de culture sont généralement adéquates pour la pratique clinique. De plus, les méthodes moléculaires n’apportent aucun avantage supplémentaire à la différenciation des cultures. infection de la colonisation de l’up par voies respiratoires Néanmoins, les NADT multiplex pour les bactéries telles que S pneumoniae, Haemophilus influenzae et Streptococcus pyogenes ont été évalués dans des échantillons respiratoires et seront probablement incorporés dans de plus grands tests de multiplexage.

LES DÉFIS DE L’ÉVALUATION DES DONNÉES EXISTANTES

ld de l’évaluation diagnostique La plus fondamentale était la confusion concernant l’utilisation des termes « sensibilité » et « spécificité », et les évaluations nécessaires pour mesurer ces paramètres La distinction entre les caractéristiques de performance « analytiques », par opposition à « diagnostic » ou Pour les NADT, la sensibilité analytique se réfère à la concentration la plus faible de cible détectable, tandis que la spécificité analytique mesure la spécificité analytique, ce qui est particulièrement vrai dans le domaine du diagnostic moléculaire. En revanche, la sensibilité diagnostique ou clinique d’un test de détection d’acide nucléique se réfère à l’identification appropriée de tous les patients porteurs de l’agent, et la spécificité diagnostique ou clinique décrit la capacité du test à exclure les patients non infectés Les caractéristiques de performance clinique sont sujet à un certain nombre de facteurs, notamment l’état de la maladie, les variations de la concentration de la cible tout au long de la maladie, l’inhibition par d’autres substances présentes dans l’échantillon, la qualité de l’échantillon, la variabilité d’échantillonnage et la dégradation des échantillons. contre une référence ou un étalon-or Pour les tests de détection microbienne, l’étalon de référence est typiquement la culture, mais les diagnostics moléculaires sont souvent beaucoup plus sensibles à la détection des acides nucléiques que la culture pour les organismes viables, ce qui complique l’interprétation des faux positifs. Les défis de l’évaluation des tests diagnostiques sont de plus en plus reconnus depuis quelques années Par exemple, l’initiative Standards for Reporting of Diagnostic Précision propose des lignes directrices sur la déclaration des études diagnostiques, tandis que l’outil d’évaluation de la qualité leur évaluation Nevertheles s, les diagnostics respiratoires sont particulièrement limités par l’incapacité de déterminer si la détection d’un agent pathogène particulier chez un patient symptomatique indique qu’il est responsable de la maladie ou résulte d’une contamination, d’une colonisation ou d’une excrétion prolongée d’une infection antérieure non reliée, en particulier Ce problème n’est généralement pas abordé dans les études d’évaluation diagnostique, mais il est devenu plus pertinent que les diagnostics moléculaires ont élargi les limites inférieures de la détection des agents pathogènes de plusieurs ordres de grandeur. Les tentatives pour répondre à cette question ont suggéré une catégorie supplémentaire de test de performance, la spécificité «épidémiologique» d’un test, pour décrire la capacité d’un test à attribuer un statut étiologique réel à un pathogène pour une maladie spécifique Enfin, la détermination de la spécificité épidémiologique d’un diagnostic respiratoire nécessiterait l’interprétation des résultats microbiologiques conjonction avec tous ot Ses données cliniques et de laboratoire, peut-être sous la forme d’un modèle prédictif. Ces analyses sont rares mais seront un objectif principal de l’étude PERCH. Les diagnostics respiratoires sont compliqués par l’absence d’un étalon or parfait. La culture est difficile ou insensible pour certains pathogènes. par exemple, métapneumovirus humain, type parainfluenzavirus, rhinovirus C ou Pneumocystis jiroveci Les tests sérologiques ne sont souvent pas disponibles et nécessitent généralement des échantillons de sérum appariés pour des résultats précis. Des méthodes statistiques pour ajuster ces étalons d’or alliés, comme l’analyse discordante, ont été fréquemment utilisées. Les évaluations comparatives des tests diagnostiques respiratoires doivent également prendre en compte les variations dans lesquelles le panel de pathogènes est sélectionné, quelles séquences génétiques sont ciblées, quelles sources d’échantillons sont utilisées , et même méthodes sont utilisées pour l’extraction des acides nucléiques Food and Drug Administrat À mesure que l’évaluation de PERCH progressait, les concepts issus de nos délibérations ont été regroupés dans une liste d’attributs souhaitables et essentiels résumant notre stratégie d’évaluation. gamme de performances des tests, sources d’échantillons acceptables, sensibilité et spécificité, préoccupations opérationnelles, besoins en espace, débit de dosage, programmes d’assurance qualité, exigences de maintenance et disponibilité des réactifs, et enjeux stratégiques capacité d’automatisation, polyvalence et utilité future, démarrage et Nous avons présenté notre résumé au Groupe de travail sur les méthodes de pneumonie, un comité d’experts formé pour conseiller PERCH. En fin de compte, cet aperçu des principales qualités et données nous a permis d’articuler nos pensées et de communiquer notre stratégie plus efficacement. collaborateurs, conseillers et testeurs pers

Souhait de détecter les pathogènes cibles Facilité d’utilisation, flux de travail et espace Haute sensibilité et spécificité analytiques démontrées Rapidité d’exécution élevée Preuve de sensibilité et de spécificité cliniques élevées Procédure d’extraction d’acide nucléique incluse dans le processus global et automatisé Capacité à traiter une variété d’échantillons respiratoires Petites exigences de volume d’échantillons Exigences de collecte d’échantillons bien caractérisées et adaptées aux études sur le terrain Réactifs facilement disponibles Exigences de stockage en température Inclusion des échantillons de contrôle et des procédures de contrôle de la qualité Capacité de fournir des résultats quantitatifs ou semi-quantitatifs Maintenance et assistance disponibles Licencié par une autorité d’accréditation Possibilité de développement Informations sur les coûts disponibles Souhaitable Essentiel Flexibilité pour modifier les cibles existantes ou en incorporer de nouvelles Possibilité de détecter les agents pathogènes cibles Facilité d’utilisation, flux de travail et espace Haute sensibilité et spécificité analytiques élevées Délais d’exécution rapides Sensibilité clinique et spécificité élevées Procédure d’extraction des acides nucléiques inclus dans le processus global et automatisé Capacité de traiter une variété d’échantillons respiratoires Petites exigences de volume d’échantillons Exigences de prélèvement d’échantillons bien caractérisées et adaptées aux études de terrain Réactifs disponibles avec de longues dates de péremption et conditions de stockage à température ambiante Inclusion d’échantillons témoins et contrôle de qualité Procédures Capacité à fournir des résultats quantitatifs ou semi-quantitatifs Maintenance et assistance disponibles Autorisé par une autorité d’accréditation Délai de développement acceptable Informations détaillées sur les coûts disponibles Voir LargeWe a appliqué notre liste d’attributs à plus d’une douzaine de systèmes de diagnostic candidats répondant à nos critères initiaux et a développé une courte liste de plateformes candidates. Nous avons ensuite testé ces tests finaux dans nos laboratoires affiliés PERCH en utilisant un ensemble normalisé de spécimens fictifs. nous a permis de collaborer avec les fabricants de tests et leurs partenaires académiques, de comparer directement les performances des plates-formes et d’acquérir des informations essentielles qui ne pouvaient être acquises que par des expériences pratiques, telles que le transfert de technologie, la facilité d’utilisation et le workflow Les détails de cette évaluation feront l’objet d’un article séparé

CONCLUSIONS

En incluant une phase pour le développement du protocole, les chercheurs de PERCH ont pu effectuer un examen approfondi de la littérature sur les diagnostics respiratoires, exposer clairement les principales préoccupations théoriques et pratiques et engager un groupe d’experts pour un apport critique. Notre évaluation a mis en évidence de nombreux avantages de cette technologie, y compris une excellente sensibilité et adaptabilité pour une gamme complète de pathogènes respiratoires et de sources d’échantillons, ainsi que des capacités claires pour le multiplexage et l’automatisation Nous avons néanmoins réalisé que nos conclusions ne représentent qu’un instantané, et le domaine du diagnostic moléculaire évolue rapidement, avec des améliorations constantes de précision, de rapidité, d’automatisation et de coût. On peut toutefois s’attendre à ce que les méthodes d’évaluation des diagnostics respiratoires continuent d’évoluer parallèlement. réponses à la pratique un nd défis conceptuels qui ont façonné le développement d’une stratégie de test de diagnostic pour PERCH

Remarques

Remerciements

Nous remercions Bhagvanji Thumar et Trevor Anderson pour leur soutien technique et leurs conseils

Avertissement

Le contenu de cet article relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de NCRR ou des National Institutes of Health

Aide financière

Ce travail a été soutenu par une subvention de The Bill & amp; Fondation Melinda Gates au Centre international d’accès aux vaccins, Département de la santé internationale, École de santé publique Johns Hopkins Bloomberg, et le Centre national de recherche Ressources NCRR subvention KLRR- à N B

Supplément de parrainage

Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé «Pneumonia Etiology Research for Child Health», parrainé par une subvention de The Bill & amp; Fondation Melinda Gates au projet PERCH de l’école de santé publique Johns Hopkins Bloomberg, Baltimore, Maryland

Conflits d’intérêts potentiels

Tous les auteurs: Aucun conflit rapporté Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués