Réaction en chaîne de la polymérase bactérienne à large spectre pour la détection précoce de la méningite bactérienne

Le diagnostic de méningite bactérienne dépend souvent de l’isolement des bactéries en culture, ce qui peut conduire à un diagnostic rapide, ce qui guiderait le clinicien dans les décisions de traitement antimicrobien. Cette étude a déterminé l’utilité clinique de la PCR pour le diagnostic. de la méningite avec utilisation d’une large gamme d’amorces bactériennes Soixante-quatorze échantillons de liquide céphalo-rachidien prélevés chez des patients ont été soumis à une PCR avec utilisation d’amorces dérivées de régions conservées du gène de l’ARN S bactérien. suit: sensibilité,%; spécificité,%; valeur prédictive positive,%; et valeur prédictive négative,% PCR bactérienne à large spectre peut être utile pour exclure le diagnostic de méningite, et les résultats peuvent influencer la décision d’initier ou d’interrompre un traitement antimicrobien

Aux Etats-Unis, l’incidence de la méningite bactérienne est de l’ordre de 1 cas par personne et par an, avec un taux de mortalité de% en%, ce qui conduit à une Le diagnostic et le traitement rapides sont critiques, car des séquelles neurologiques permanentes telles que la perte auditive, le retard mental, les convulsions et les changements de comportement peuvent survenir chez jusqu’à la moitié des survivants. Signes cliniques classiques Cependant, chez les nouveau-nés et les personnes âgées, seuls des signes subtils, tels que la léthargie et l’irritabilité, peuvent annoncer l’apparition de la méningite Le traitement antibiotique est empirique. initié sur la base des résultats cliniques Le diagnostic de la méningite dépend des résultats de la culture des échantillons de sang et de LCR et des résultats de l’analyse microscopique et chimique des échantillons de LCR. La thérapie définitive est guidée par les résultats de la culture. Les tests de sensibilité aux antibiotiques peuvent nécessiter un h supplémentaire. Ainsi, les informations nécessaires pour un traitement antimicrobien spécifique ne sont pas disponibles pour les premiers jours de la maladie pour lesquels un diagnostic de méningite bactérienne est posé, le patient, la famille et le clinicien peuvent tous En outre, une prophylaxie peut être utilisée en cas de suspicion de méningite à méningocoque. Ces considérations soulignent la nécessité d’un test diagnostique rapide et précis de la méningite bactérienne. L’amplification de l’ADN bactérien est une méthode potentielle de détection rapide de la méningite bactérienne. technique a été utilisée pour identifier des organismes tels que Streptococcus pneumoniae résistant à la pénicilline , Neisseria meningitidis , streptocoques du groupe B , Listeria monocytogenes , et Mycobacterium tuberculosis en utilisant des amorces spécifiques à l’espèce. nous avons sélectionné une amorce à large spectre qui pourrait détecter la plupart sinon tous les pathogènes bactériens soumis à un laboratoire de microbiologie L’utilité de ce test diagnostique serait de déterminer si un traitement antimicrobien empirique devrait ou non être administré et ainsi potentiellement éliminer l’administration inutile d’un traitement antimicrobien à certains patients. En l’absence d’informations spécifiques sur la sensibilité aux antimicrobiens, le test Notre objectif était de déterminer l’utilité d’une PCR bactérienne BRB-PCR à large spectre en tant que technique de diagnostic rapide pour la détection de la méningite bactérienne et de délimiter les caractéristiques du test, y compris la sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive, et valeur prédictive négative

Méthodes

La coloration de Gram a été réalisée avec un spécimen de cytocentrifugation. Des échantillons de LCR ont été inoculés sur de la gélose au sang, de la gélose au chocolat et du bouillon enrichi. Le CSF restant a été soumis à des tests de microbiologie, de chimie et d’hématologie. L’échantillon a été stocké à – ° C pour analyse ultérieure par lots au Département de Médecine Laboratoire de Recherche en Biologie Moléculaire, Hôpital St John et Centre Médical Détroit, Michigan Soixante-quatorze échantillons étaient disponibles pour analyse Les techniques d’amplification de l’ADN conservées à – ° C étaient décongelées. brièvement centrifugé dans une microcentrifugeuse Une aliquote A-μL du surnageant a été transférée dans un microtube stérile et bouillie pendant min. dérivé de régions hautement conservées du gène de l’ARN S bactérien ‘-GGAGGAAGGTGGGGATGACG -‘ d ‘-ATGGTGTGACGGGCGGTGTG-‘ Cette amorce est connue comme une amorce « universelle » en raison de sa capacité à amplifier un produit -bp de n’importe quelle espèce bactérienne.Une solution de mélange maître constituée de μM de chaque amorce, μM de MgCl, × tampon PCR On a utilisé le mélange de PCR dans un modèle de thermocycleur; Perkin Elmer pour les cycles Les paramètres étaient les suivants: dénaturation pour s à ° C, hybridation pour s à ° C et extension pour s à ° C Vingt microlitres de la réaction PCR ont été chargés sur un gel d’agarose% contenant du bromure d’éthidium μg / mLPresence d’une bande -bp a été considéré comme un résultat positif La fiabilité du test PCR pour la bande -bp a été précédemment établie par d’autres chercheurs; ainsi, il n’était pas nécessaire de séquencer le produit de PCR Quand utilisé avec S pneumoniae ATCC American Type Culture Collection, la limite de détection de ce test était & lt; cfu / mL, tel que déterminé par dilution en série Les témoins négatifs inclus dans chaque série étaient l’ADN placentaire humain, les réactifs PCR seulement, et un échantillon de LCR qui était connu comme culture négative et qui ne contenait pas de globules blancs. On a également examiné les échantillons d’ATCC pneumoniae pour détecter les inhibiteurs de PCR et / ou la dégradation de l’ADN. On a obtenu des échantillons négatifs avec S pneumoniae ATCC dans le tube de réaction avant de procéder à un nouveau test.

Figure Vue largeDownload slideRésultats de PCR bactérienne à large spectre avec utilisation d’échantillons CSF dans une étude de méningite bactérienne. Voies C-J, Résultats d’une PCR bactérienne à large spectre avec utilisation d’échantillons CSF obtenus chez des patients présentant des signes microbiologiques de méningite bactérienne positive résultats de culture ou de coloration de Gram Le résultat PCR positif est le produit -bp Voie A, étalon de taille moléculaire; voie B, source de placenta humain à ADN non bactérien, servant de témoin négatif; voie K, produit de PCR bactérienne à large spectre pour Streptococcus pneumoniae ATCC American Type Culture Collection, servant de témoin positifFigure View largeDownload slideRésultats de PCR bactérienne à large spectre avec utilisation d’échantillons de LCR dans une étude de méningite bactérienne Voies C-J, Résultats de PCR bactérienne à large spectre avec utilisation d’échantillons de LCR obtenus chez des patients présentant des signes microbiologiques de méningite bactérienne, c.-à-d. résultats positifs de culture ou de coloration de Gram Le résultat PCR positif est -pb produit Lane A, standard de taille moléculaire; voie B, source de placenta humain à ADN non bactérien, servant de témoin négatif; voie K, produit d’une PCR bactérienne à large spectre pour Streptococcus pneumoniae ATCC American Type Culture Collection, servant de témoin positif Caractéristiques du patient Les données médicales ont été examinées pour des données concernant l’âge, les maladies associées, la durée totale du traitement antimicrobien, les résultats, Sur la base de la culture et des résultats de coloration de Gram et des numérations leucocytaires, les patients ont été divisés en groupes. Le « groupe sans infection » était constitué de patients qui n’avaient aucune preuve cellulaire ou microbiologique d’infection, c.-à-d. , aucun WBCs dans le CSF, aucun organisme vu sur l’évaluation microscopique directe d’une coloration de Gram, et les résultats négatifs de culture; le groupe «CSF WBC-positif» comprenait des patients qui n’avaient pas de preuve microbiologique d’infection, comme déterminé par des résultats négatifs de coloration et de culture de Gram, mais qui avaient une réponse cellulaire dans le compte CSF WBC, & gt; cellules / mm; et le groupe «infecté» était constitué de patients présentant des signes microbiologiques d’infection, déterminés par un résultat positif de culture ou de coloration de Gram des échantillons de LCR. Efficacité du test La sensibilité, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative ont été déterminées définitions Les IC% pour la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives ont été calculés selon la méthode de Newcombe

Résultats

Les caractéristiques démographiques, les maladies associées, la numération CSF et systémique et les données sur la thérapie antimicrobienne et les résultats de culture pour les groupes d’étude sont résumés dans le tableau Comme prévu, les patients du groupe infecté présentaient des numérations globales et CSF plus élevées, un risque plus élevé de maladies, et une durée moyenne plus longue ± écart-type du traitement ± jours que ne l’a fait l’un ou l’autre groupe CSF groupe WBC-positif, ± jours; groupe de non-infection, ± jours Les résultats microbiologiques pour les échantillons obtenus des patients infectés sont présentés dans le tableau Le taux élevé d’isolement de Staphylococcus epidermidis est compatible avec la présence de dispositifs implantés neurochirurgicalement Deux patients ont eu des résultats positifs de coloration de Gram Le test de PCR était positif dans tous les cas Dans le groupe sans infection, il n’y avait pas de résultats positifs aux tests de BRB-PCR Dans le groupe CSF WBC-positif, seul le résultat de dosage de BRB-PCR était positif. Par conséquent, la PCR a détecté une infection du LCR dans cet échantillon, alors que la culture et la coloration de Gram ne l’ont pas été. Dans l’analyse des caractéristiques du test, le résultat positif dans le groupe CSF WBC-positif a été considéré. être faussement positif Les résultats du test BRB-PCR et des techniques microbiologiques sont comparés dans le tableau

Tableau View largeDownload slideCaractéristiques des patients et des échantillons CSF dans une étude de PCR bactérienne à large spectre pour la détection précoce de la méningite bactérienneTable View largeTélécharger la lameCaractéristiques des patients et des échantillons CSF dans une étude de PCR bactérienne à large spectre pour la détection précoce de la méningite bactérienne

Tableau View largeTélécharger les résultats microbiologiques pour les patients présentant des signes microbiologiques d’infection, tels que déterminés par des résultats positifs de culture ou de coloration de GramTable View largeTélécharger les résultats microbiologiques pour les patients présentant des signes microbiologiques d’infection, déterminés par des résultats positifs de culture ou de coloration de Gram

Tableau View largeTélécharger la lameComparaison des résultats microbiologiques et PCR bactérienne à large spectre Résultats BRB-PCR pour des échantillons de LCR obtenus chez des patients soupçonnés d’avoir une méningite bactérienneTable View largeTélécharger slideComparaison des résultats microbiologiques et PCR bactérienne à large spectre Résultats BRB-PCR pour les échantillons de LCR obtenus chez les patients suspectés d’avoir une méningite bactérienne La sensibilité de la BRB-PCR par rapport aux techniques microbiologiques était de% IC%,% -%; des échantillons testés positifs avec l’utilisation de techniques microbiologiques ont donné des résultats positifs en BRB-PCR; la spécificité était%% CI,% -%; des échantillons qui ont été testés négatifs avec l’utilisation de techniques microbiologiques ont eu des résultats de BRB-PCR négatifs; la valeur prédictive positive était%% CI,% -%; des échantillons avec des résultats BRB-PCR positifs ont également été testés positifs avec l’utilisation de techniques microbiologiques; et la valeur prédictive négative était%% CI,% -%; d’échantillons avec des résultats de BRB-PCR négatifs également négatifs avec l’utilisation de techniques microbiologiques

Discussion

La BRB-PCR est une méthode sensible qui ne dépend pas de la présence d’organismes viables, ce qui la rend plus applicable dans les cas où le patient a déjà reçu un traitement antibiotique. Dans une étude similaire à la nôtre, Dicuonzo et al. Patients avec des résultats de culture négatifs mais pas d’amplicon spécifique identifié par les sondes étudiées Cette étude n’a pas évalué les paramètres cliniques pouvant expliquer les résultats mais suggéré qu’il y avait probablement des pathogènes nosocomiaux qui ne seraient pas détectés par les sondes utilisées, y compris les espèces Streptococcus, N meningitidis , Haemophilus influenzae, et M tuberculosis Dans une autre étude qui a examiné la bactériémie chez les patients présentant de la fièvre et de la neutropénie, des patients ayant reçu des antibiotiques au moment des prélèvements de sang pour la culture ont détecté de l’ADN bactérien dans le sang. amplification génique Comme dans notre étude, les auteurs ont suggéré que la PCR de l’ADN bactérien peut augmenter mais non remplacer La culture comme méthode de détection En outre, seuls les patients ayant obtenu des résultats PCR positifs dans notre tableau d’étude ont eu des résultats positifs de coloration de Gram. Ainsi, la microscopie directe conventionnelle n’a toujours pas une sensibilité suffisante pour le diagnostic de méningite. La PCR est que les échantillons de LCR prélevés chez des personnes non infectées sont normalement stériles et qu’il n’y a pas de problème de colonisation bactérienne qui fausse les résultats de la PCR, ce qui se produit avec des échantillons provenant d’autres organes tels que les voies respiratoires. Notre étude prolonge l’observation récente de Rantakokko-Jalava et al , qui ont étudié les échantillons de LCR et constaté qu’ils avaient des résultats de PCR positifs et des résultats de culture positifs. une sensibilité de% et une spécificité de% Ce travail important a eu de nombreux r résultats faussement négatifs, mais une sensibilité encore inférieure à celle trouvée dans notre étude. Une limitation de notre étude est que, par nature, la BRB-PCR n’utilise pas d’amorces bactériennes spécifiques. Si les tests initiaux de BRB-PCR donnent des résultats positifs, une une PCR ultérieure pourrait être réalisée avec des amorces spécifiques des agents bactériens les plus courants pour confirmer le diagnostic. Une autre option serait une approche multiplex, dans laquelle plusieurs amorces sont utilisées pour noter la présence de bactéries par BRB-PCR ainsi que des pathogènes spécifiques, tels que S pneumoniae et N meningitidis La limitation à cette approche est qu’un grand nombre d’amorces devrait être utilisé pour détecter toutes les souches présentées dans le tableau. De plus, il resterait nécessaire d’effectuer des tests de sensibilité aux antimicrobiens sur les isolats récupérés de la culture. Étant donné que seuls les spécimens ont été examinés dans cette étude, d’autres chercheurs et centres devraient également évaluer de manière critique la méthode BRB-PCR avant son adoption généralisée viagra générique. Dans cette étude, les démons BRB-PCR excellentes caractéristiques du test diagnostique, avec une haute sensibilité%, une spécificité%, une valeur prédictive positive% et une valeur prédictive négative% Ces résultats sont basés sur un standard microbiologique: un résultat positif de culture ou de coloration de Gram Nos résultats se comparent favorablement aux résultats étude de Kotilainen et al , qui a évalué les patients atteints de méningite et trouvé une sensibilité de% et une spécificité de% En revanche, notre étude a utilisé des cycles d’amplification entraînant une sensibilité améliorée et a été appliquée à une plus grande variété d’espèces bactériennes. al a évalué une PCR universelle sur des échantillons de CSF avec seulement des résultats de culture positifs et a trouvé une sensibilité de%, ce qui est comparable aux résultats de notre étude Notre étude étend les observations avec une PCR universelle et les résultats évalués par rapport à traitement antimicrobien, ce qui pourrait conduire à des résultats de culture négatifs, mais des résultats positifs BRB-PCR Il y a un risque de surutilisation de l’antibiotique s si des échantillons donnant des résultats BRB-PCR positifs et des résultats de culture négatifs dictent un traitement, car nous ignorons depuis combien de temps le matériel génomique bactérien persiste dans le LCR après le début du traitement. Néanmoins, nous croyons que la BRB-PCR peut être utile Si la BRB-PCR donne des résultats positifs, la décision du clinicien d’administrer un traitement antimicrobien est prise en charge Si les résultats sont négatifs, le clinicien pourrait envisager d’autres diagnostics plus rapidement. En raison de la nécessité de tests de sensibilité aux antimicrobiens, il convient de le considérer comme un complément aux tests de culture et de sensibilité aux antimicrobiens. La BRB-PCR mérite un examen plus approfondi pour établir la fiabilité et la reproductibilité avant qu’elle ne devienne un test de dépistage. un test largement utilisé pour le diagnostic rapide de la méningite bactérienne

Remerciements

Nous remercions Ruth Moore, pour avoir révisé le manuscrit, et Patricia Schultz, pour la préparation du manuscrit